Luz, João Pedro Martins daReis, Carlos Manuel Gaspar dosSilva, M.C.A.2014-09-252016-09-2520142013http://hdl.handle.net/10400.11/2525Dissertação apresentada à Escola Superior Agrária do Instituto Politécnico de Castelo Branco para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Fruticultura Integrada.A bactéria Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. é o agente responsável pela doença vulgarmente designada por fogo bacteriano. A doença foi detetada pela primeira vez na Europa, em 1957, no sul de Inglaterra e desde então tem-se difundido por todo o continente europeu. Atualmente está presente em 49 países, distribuídos por todos os continentes, afetando fundamentalmente espécies da subfamília Maloideae, onde se incluem as pomoideas e ainda diversas espécies ornamentais ou silvestres. Face à existência, no nosso país, de dois focos de fogo bacteriano assinalados, em 2006 e entretanto erradicados, e ao aparecimento de novos focos em 2010 e 2011, o combate e erradicação da doença é premente para que Portugal continue a gozar do estatuto de “zona protegida”. Para o efeito, considera-se fundamental a identificação e caraterização dos isolados bacterianos que estão a infetar os pomares portugueses. Neste trabalho, foram avaliados 44 isolados obtidos, entre 2006 e 2011, de plantas sintomáticas de macieira e pereira. A identificação de E. amylovora foi realizada através de testes fisiológicos e bioquímicos, de PCR e de patogenicidade, de acordo com os procedimentos indicados pela EPPO e os definidos por outros autores. Apenas 25% dos isolados evidenciaram paragem de crescimento a 36ºC. Este número aumentou para 68% quando as colónias foram sujeitas a uma temperatura de 39ºC. Esta constatação pode evidenciar uma adaptação da bactéria às nossas condições climáticas. A utilização do citrato de sódio, da L-ramnose e da amigdalina, verificada em alguns isolados, aponta para o facto de alguns isolados portugueses pertencerem ao grupo minoritário de estirpes que utilizam aqueles compostos. Os isolados suspeitos de pertencerem à espécie E. amylovora mostraram-se pouco homogéneos no que respeita à caraterização bioquímica efetuada no sistema API 20E, dado que resultaram 21 perfis. Destes isolados, 65% mostraram ser positivos na identificação por ácidos nucleicos, com a técnica descrita por Bereswill et al. (1992) e 74% revelaram-se patogénicos em frutos imaturos de pera e nêspera. Somente metade dos isolados apresentou resultados coincidentes com o expectável para a bactéria E. amylovora. Dos isolados estudados, 26% mostraram-se negativos para E. amylovora, uma vez que se revelaram, simultaneamente, negativos no teste de patogenicidade e na amplificação com os primers de Bereswill et al. (1992). Os isolados obtidos em 2010 e 2011, inoculados em pera e nêspera, produziram, de um modo geral, infeções mais rapidamente que os isolados obtidos entre 2006 e 2009, o que leva a presumir tratarem-se de isolados mais virulentos. Considera-se de interesse continuar os estudos de caraterização fisiológica, bioquímica e molecular dos isolados portugueses, pois o conhecimento da bactéria E. amylovora, nas nossas condições, contribuirá para um melhor controlo e erradicação.The bacterium Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. is the causal agent for the disease commonly known as Fire blight. The disease was first detected in Europe in 1957, in the south of England and since then has spread throughout the European continent. It is currently present in 49 countries across all continents, mainly affecting species of the Maloideae subfamily, where pome fruits and several ornamental or wild species are included. Given the two outbreaks of fire blight in Portugal, reported in 2006 and apparently eradicated, and the new outbreaks in 2010 and 2011, control and eradication of the disease is urgent so that Portugal continues to enjoy the status of "protected area". For this purpose, it is fundamental to identify and characterise the bacterial strains that are infecting Portuguese orchards. Forty-four isolates obtained from symptomatic pear and apple plant trees, between 2006 and 2011, were evaluated. E amylovora identification was carried out by physiological and biochemical, PCR and pathogenicity tests, accordingly with the procedures set out by EPPO and the defined by other authors. Only 25% of the isolates showed growth stop at 36°C, although this number increased to 68% when the colonies were subjected to a temperature of 39ºC. This finding may show an adaptation of bacteria to our climatic conditions. The use of sodium citrate, L-rhamnose, and amygdalin by a few isolates, points to the fact that some Portuguese isolates belong to the minority group of strains that utilise these compounds. Isolates suspected to be E. amylovora showed little homogeneity in the biochemical characterisation carried out on API 20E system, resulting 21 different profiles. Of these isolates, 65% showed to be positive in the identification by nucleic acids, with the technique described by Bereswill et al. (1992) and 74% proved to be pathogenic on immature fruits of pear or loquat. Results equal to the expected for E. amylovora were only shown by half of the isolates. Twenty-six percent of the isolates showed not to be E. amylovora, since they were negative both in the pathogenicity testing and in the amplification with the Bereswill et al. (1992) primers. The isolates obtained in 2010 and 2011, inoculated in pear or loquat, produced, in general, infections faster than the isolates obtained between 2006 and 2009, leading to assume that they are more virulent isolates. It is considered of great interest to continue the physiological, biochemical, and molecular characterisation studies of the Portuguese isolates, because knowledge of E. amylovora under Portuguese conditions will contribute to a better control and eradication.porFogo bacterianoMacieiraPereiraMalus domesticaPyrus communisPCRmaster thesis201060337