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- Rapid, simple and potentially universal method for DNA extraction from Opuntia spp. fresh cladode tissues suitable for PCR amplificationPublication . Raimundo, Joana; Reis, C.M.G.; Ribeiro, M.M.A.In Opuntia spp., the cladode tissues contain many polysaccharides and secondary metabolites that interfere with obtaining high-quality deoxyribonucleic acid (DNA), using currently available methods. To circumvent this problem, three commercial kits, three modified versions of the conventional cetyltrimethylammonium bromide method (CTAB) method and one combined method were tested in Opuntia ficus-indica, O. robusta, O. dillenii and O. elata species. We obtained a rapid and simple protocol that allows the extraction of DNA from all the tested species with good DNA yield and purity, namely, the combined method. With this method (DNeasy® Plant Mini Kit combined with the CTAB method), DNA yields from 13.2 ± 7.8 to 15.9 ± 11.3 µg.g-1 of fresh tissue were obtained in the four Opuntia species. The purity, evaluated by the ratio A260/A280 ratio, ranged from 1.67 ± 0.12 to 2.01 ± 0.25, revealing low levels of problematic metabolites. The extracted DNA quality was confirmed by amplifying a set of nuclear microsatellites obtained for the genus. Reliable reproducible bands and electropherogram profiles were obtained. The combined method has potential to be universal for good-quality DNA extraction in cacti, particularly in the Opuntia genus and other difficult-to-extract species.
- Otimização da extração de DNA a partir de cladódios de Opuntia spp.Publication . Raimundo, Joana; Reis, C.M.G.; Ribeiro, M.M.A.Existe um interesse crescente pelas espécies do género Opuntia spp. devido à sua rusticidade e às várias possibilidades de utilização económica que estas representam, nomeadamente na produção de fruto, forragem e nas indústrias farmacêutica e cosmética. A caracterização da diversidade genética por marcadores moleculares bem como a avaliação de germoplasma é importante no melhoramento de plantas e no desenvolvimento de novas cultivares. As plantas do género Opuntia spp. caraterizam-se por conter muitos polissacarídeos e metabolitos secundários que interferem na obtenção de DNA de alta qualidade. Por esta razão, vários métodos descritos na literatura e ‘kits’ comerciais disponíveis são, frequentemente, pouco eficazes na extração de DNA genómico. De modo a contornar este problema, foram testadas várias metodologias de extração de DNA a partir de cladódios de quatro espécies do género Opuntia (O. ficus-indica, O. robusta, O. dillenii e O. elata). Utilizaram-se três ‘kits’ comerciais, três versões modificadas do método padrão de brometo de cetil trimetil amónio (CTAB) e um método, por nós melhorado, que se baseia no método CTAB combinado como ‘mini kit’ comercial Plant DNeasy® (Qiagen). O protocolo combinado, permite a rápida extração de quantidades razoáveis de DNA genómico de alta qualidade em cladódios de todas as espécies utilizadas, destacando-se a O.dillenii e a O.elata como espécies onde o teor de polissacarídeos e metabolitos secundários é muito elevado. Foram obtidos em O. ficus-indica, O. robusta, O. dillenii e O. elata rendimentos em DNA de 10.5, 12.0, 13.2 e 15.9 μg.g-1 de tecido fresco, respetivamente. Com este protocolo, a pureza, avaliada pela razão A260/A280, foi respectivamente de 1.89, 1.75, 1.67 e 2.01. No entanto, quando utilizado isoladamente, o mini kit Plant DNeasy® permite extrair facilmente DNA de O. ficus-indica e O. robusta com rendimentos de 18.3 e 12.5 μg.g-1 de tecido fresco, respetivamente. Neste caso, a pureza, avaliada pela referida razão, foi de 1.84 e 1.74, respetivamente. A qualidade do DNA extraído foi confirmada pela amplificação de um conjunto de microsatélites nucleares obtidos para o género Opuntia spp. Da análise dos produtos amplificados, por electroforese em gel de agarose e eletroforese capilar em sequenciador, verificaram-se perfis de bandas e eletroferogramas reprodutíveis.